En 1453, immédiatement après la chute de Constantinople par les Ottomans, la basilique fut convertie en mosquée, conservant le même nom, Ayasofya, comme symbole de la conquête. Contrairement au sort d'une grande majorité d'édifices chrétiens, soumis aux pillages intensifs des troupes du sultan, Sainte-Sophie fut épargnée sur ordre de Mehmed II, qui lui attachait une grande importance. À cette époque, le bâtiment était très délabré : plusieurs de ses portes ne tenaient plus. Cet état de la basilique a été décrit par plusieurs visiteurs occidentaux, comme le gentilhomme cordouan Pero Tafur et le Florentin Cristoforo Buondelmonti. Le sultan Mehmed II ordonna le nettoyage immédiat de l'église et sa conversion en une mosquée. Contrairement aux autres mosaïques et peintures murales des églises de la ville, la mosaïque de Marie dans l'abside de Sainte-Sophie ne fut pas, pour des raisons obscures, recouverte de lait de chaux par ordre de Mehmed II. Pendant cent ans, elle fut couverte d'un voile puis eut le même traitement que les autres. Le sultan suivant, Bajazed II, fit ériger un nouveau minaret, en remplacement de celui construit par son père.
Au XVIe siècle, le sultan Soliman le Magnifique (1520-1566) rapporta deux chandeliers colossaux de sa conquête de la Hongrie. Ils furent placés de chaque côté du mihrab. Mais au cours du règne de Sélim II (1566-1577), le bâtiment commença à montrer des signes de fatigue et dut être stabilisé par l'ajout de contreforts externes massifs. Ces travaux d'envergure furent accomplis par le grand architecte ottoman Sinan, qui construisit les deux autres grands minarets de l'extrémité ouest du bâtiment, la loge originale du sultan et le mausolée de Sélim II, au sud-est, en 1577. Les mausolées de Murad III et Mehmed III furent construits à ses côtés dans les années 1600.
D'autres additions ont été réalisées plus récemment, comme le minbar (estrade pour les sermons) décoré de marbres, et la loggia pour le muezzin. Le sultan Murad III (1574-1595) plaça des deux côtés de la nef les deux grandes urnes hellénistiques en albâtre, transportées depuis Pergame. Le sultan Mahmud Ier ordonna la restauration de l'édifice en 1739 et ajouta une médersa (une école coranique, actuellement la bibliothèque du musée), une soupe populaire (pour la distribution aux pauvres), une bibliothèque et, en 1740, une fontaine d'ablutions rituelles (Şadirvan), transformant ainsi le bâtiment en un külliye, c'est-à-dire un vaste complexe social. Dans le même temps furent construits une nouvelle galerie pour le sultan, ainsi qu'un nouveau mihrab.
La mieux connue des restaurations de Sainte-Sophie fut celle menée entre 1847 et 1849 par le sultan Abdülmecid, accomplie par plus de 800 ouvriers dirigés par deux architectes italo-suisses, les frères Gaspare et Giuseppe Fossati. Les travaux portèrent sur la consolidation de la coupole et des voûtes, le redressement des colonnes et la révision de la décoration intérieure et extérieure. Les mosaïques de la galerie furent nettoyées. Les anciens lustres furent remplacés par de nouvelles suspensions plus facilement accessibles. Des panneaux circulaires gigantesques furent accrochés aux quatre piliers centraux, inscrits des noms d'Allah, du prophète Mahomet et des quatre premiers califes Abu Bakr, Omar, Uthman et Ali, ainsi que de ceux des deux petits-enfants de Mahomet : Hassan et Hussein, par le calligraphe Kazasker İzzed Effendi (1801-1877). En 1850, les Fossati construisirent une nouvelle galerie du sultan dans le style néo-byzantin, reliée au pavillon royal situé derrière la mosquée. À l'extérieur du bâtiment furent érigés un nouveau bâtiment pour le gardien du temps et un nouveau medrese. Les minarets furent modifiés de manière à égaliser leurs hauteurs respectives. La restauration achevée, la mosquée fut rouverte dans de fastueuses cérémonies, le 13 juillet 1849.